Genetica (6/8): Dal gene alla proteina

Nel 1909 il medico britannico Garrod fù il primo a suggerire che i geni determinano il fenotipo attraverso l'azione di enzimi che catalizzano specifiche reazioni chimiche nella cellula, sostenendo che i sintomi di una malattia ereditaria derivano dall'incapacità di un individuo di produrre un determinato enzima.
Un'altra prova decisiva sull'ipotesi che un gene produce uno specifico enzima, fù data da Beadle e Tatum con i loro studi sulla muffa del pane.

Non tutte le proteine sono enzimi, e quindi è giusto dire che un gene = un polipeptide.

I geni contengono le istruzioni per la costruzione delle proteine, ma il DNA non le produce direttamente, di questo se ne occupa l'RNA, che è chimicamente simile al DNA con la differenza che contiene lo zucchero ribosio invece che la timina, inoltre è costituito quasi sempre da un singolo filamento.
Nel DNA o nell'RNA i monomeri sono i 4 tipi di nucleotidi che si distinguono per le proprie basi azotate, e i geni sono solitamente costituiti da centinaia o migliaia di nucleotidi, ognuno con una specifica sequenza di basi.
Gli acidi nucleici e le proteine contengono informazioni scritte in linguaggi chimici diversi.
Per passare dal DNA alla proteina sono necessari 2 passaggi:

Trascrizione: è la sintesi dell'RNA diretta dal DNA, dove l'informazione viene semplicemente trascritta con lo stesso linguaggio da una molecola ad un'altra.
Un filamento di DNA funge da stampo per la costruzione di una sequenza di nucleotidi dell'RNA, che è una trascrizione fedele delle istruzioni geniche per la sintesi di una proteina, e questo RNA viene detto RNA messaggero (mRNA).
Traduzione: è la sintesi di un polipeptide che avviene sotto la guida dell'mRNA, dove avviene un cambiamento di linguaggio, e questa traduzione avviene nei ribosomi.

La trascrizione avviene nel nucleo e l'mRNA viene trasferito nel citoplasma dove avviene la traduzione grazie ai ribosomi.
Prima di abbandonare il nucleo l'mRNA subisce delle modifiche prima di diventare funzionale, in 2 stadi, lo stadio pre-mRNA e infine il trascritto primario (l'mRNA finale).
Quindi ricapitolando: DNA -> RNA -> proteina.

Ci sono solo 4 nucleotidi per specificare 20 amminoacidi, ma è stato scoperto che il flusso di informazione dal gene alla proteina si basa su di un codice a triplette, dove le istruzioni genetiche per una catena polipeptidica sono scritte nel DNA sotto forma di una serie di parole costituite da 3 nucleotidi (grazie alle quali ci sono 64 possibili unità codificanti più che sufficienti per ciascuno dei 20 amminoacidi).
Durante la trascrizione il gene determina la sequenza di triplette all'interno di una molecola di mRNA, dove per ogni gene solo uno dei 2 filamenti di DNA viene trascritto, e questo prende il nome di filamento stampo.
Una molecola di mRNA non è identica al suo filamento stampo, ma complementare, dove la U (che corrisponde alla T del DNA) si accoppia con la A e la C con la G.
Le triplette nucleotidiche dell'mRNA sono dette codoni, che vengono letti in direzione 5'->3' lungo l'mRNA, e ogni codone indica quale dei 20 amminoacidi sarà incorporato nella posizione corrispondente di un polipeptide.
Tutti e 64 codoni furono decifrati intorno alla metà degli anni 60 e si scoprì che ciascun codone ha specifiche funzioni o specifiche proteine, ad esempio il codone AUG ha una duplice funzione, codifica l'amminoacido metionina e da il segnale di partenza al processo di codifica (codone di inizio), inoltre, in un filamento di mRNA, i 3 codoni rimanenti non codificano amminoacidi, ma sono segnali di stop della traduzione (codoni di terminazione).
Il codice genetico è rindondante ma non ambiguo.
Ricapitolando: l'informazione genetica è codificata sotto forma di una sequenza di triplette di basi (codoni) che non si sovrappongono e ognuno dei quali durante la sintesi proteica viene tradotto in un specifico amminoacido.
Il codice genetico è quasi universale, ad eccezione di alcuni sistemi di traduzione dove i codoni differiscono da quelli normali, ma questo linguaggio quasi universale deve essere stato funzionante già dalle prime fasi della storia della vita.

Sintesi e maturazione dell'RNA

L'RNA polimerasi è un'enzima che separa i 2 filamenti di DNA e lega assieme i nucleotidi di RNA, questo enzima può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3' del polimero in crescita in modo che l'RNA si allunga nella direzione 5' -> 3'.
La sequenza di DNA alla quale si lega l'RNA polimerasi per l'inizio della trascrizione è detta promotore, la sequenza che termina la fine è detta terminatore.
La sequenza promotore è a monte del terminatore, e la porzione del DNA che viene trascritta in RNA è detta unità di trascrizione.
Gli eucarioti possiedono nel nucleo 3 tipi di RNA polimerasi (I,II,III) e quella usata per la sintesi dell'mRNA è la II.
Il promotore indica quale dei 2 filamenti di DNA venga usato come stampo, e negli eucarioti un gruppo di proteine dette fattori di trascrizione mediano il legame dell'RNA polimerasi e l'inizio della trascrizione.
L'RNA polimerasi può legarsi al promotore solo dopo che alcuni fattori di trascrizione si sono legati ad esso, e quando entrambi sono legati si parla di complesso d'inizio della trascrizione.
Un'altra sequenza cruciale del DNA promotore è la TATA box.
Una volta che la polimerasi è legata al DNA del promotore, i 2 filamenti di DNA si svolgono e l'enzima comincia a trascrivere il filamento stampo.
L'allungamento si ha mentre l'RNA polimerasi si muove lungo il DNA continuando a svolgere la doppia elica, aggiungendo nucleotidi all'estremità 3' del'RNA in crescita, la doppia elica di DNA si rigenera e la nuova molecola di RNA si stacca dal suo stampo.
Negli eucarioti la trascrizione ha una velocità di 60 nucleotidi al secondo.
Un singolo gene può essere trascritto simultaneamente da diverse molecole di RNA polimerasi che si susseguono, e ciò aumenta la quantità di mRNA trascritto.
Terminazione: la trascrizione va avanti fino a che l'RNA polimerasi non trascrive la sequenza di un terminatore di DNA, fermandosi centinaia di nucleotidi dopo il segnale AAUAAA del pre-mRNA, e a distanza di 10-35 nucleotidi a valle di AAUAAA il pre-mRNA viene tagliato, liberandosi dall'enzima.
Il sito di taglio è anche il sito per il legame di una coda di poli(A).

Ciascuna estremità di una molecola di pre-mRNA viene modificata, l'estremità 5' viene coperta con una guanina modificata, detta cappuccio al 5' che serve a proteggere l'mRNA dalla degradazione e fa da segnale di attacco ai ribosomi del citoplasma.
L'estremità 3' viene legata da una coda di poli (A) che impedisce la degradazione dell'RNA e anche lei viene coinvolta nell'attacco coi ribosomi, e sembra inoltre facilitare l'esportazione di mRNA dal nucleo al citoplasma.

Lo splicing dell'RNA consente di rimuovere una vasta porzione della molecola di RNA presente inizialmente (negli eucariotici inizialmente è di 8000 nucleotidi, quando ne bastano 1200).
Gran parte dei geni eucariotici e degli RNA possiedono lunghe sequenze nucleotidiche non codificanti che non vengono tradotte.
Le porzioni di acido nucleico non codificanti che si trovano tra le regioni codificanti sono dette introni, le altre regioni che solitamente sono tradotte vengono dette esoni.
L'RNA polimerasi trascrive introni ed esoni del DNA, ma gli introni vengono rimossi dall'mRNA dallo splicing.
Lo splicing avviene grazie a brevi sequenze nucleotidiche poste alle estremità degli introni dette snRNP, composte da proteine e RNA (snRNA).
Unendosi alle proteine formano la spliceosoma, che interagisce con i siti di splicing tagliando l'introne e unendo subito le 2 estremità dell'esone rimasto.

I ribozimi sono molecole di RNA degli introni con attività enzimatica che consentono di catalizzare la propria rimozione.

Gli introni sono importanti perchè contengono sequenze che controllano l'attività genica, e avere geni discontinui (composti da introni ed esoni) consente di codificare più di un tipo di polipeptide.
Lo splicing alternativo dell'RNA si ha quando alcuni geni danno origine a 2 o più polipeptidi diversi, a seconda di quali porzioni sono trattate come esoni durante la maturazione dell'RNA.
Questo splicing potrebbe essere il motivo per cui gli uomini sono così diversi pur avendo un corredo di geni molto basso, solo il doppio di quello del moscerino della frutta.
I domini sono quelle regioni delle proteine strutturalmente e funzionalmente distinte nate grazie ai geni discontinui, ed esoni diversi codificano domini diversi di una proteina.
Gli introni aumentano le probabilità che aumenti il rimescolamento favorevole tra geni (crossing over).

La sintesi delle proteine

L'interprete della traduzione è l'RNA transfer (tRNA) che trasferisce amminoacidi dal pool citoplasmatico a quello ribosomiale, il quale aggiunge questi amminoacidi all'estremità in accrescimento della catena polipeptidica.
I tRNA non sono tutti uguali, quando uno di essi raggiunge il ribosoma, trasporta uno specifico amminoacido legato ad una sua estremità, mentre nell'altra estremità è presente una tripletta di nucleotidi detta anticodone, che si appaia su un codone complementare dell'mRNA.
Il messaggio genetico viene quindi tradotto un codone dopo l'altro man mano che i tRNA trasportano gli amminoacidi nell'ordine previsto e questi vengon legati formando una catena da parte del ribosoma.
Negli eucariotici il tRNA è prodotto all'interno del nucleo della cellula e deve esser trasferito nel citoplasma, ed ogni molecola di esso è formata da un singolo filamento di RNA lungo 80 nucleotidi, che si ripiega su se stesso formando una molecola con struttura tridimensionale a forma di L, dove ad un'estremità c'è l'anticodone e all'altro capo c'è l'estremità 3', il sito di legame dell'amminoacido.
Esistono circa 45 molecole di tRNA, alcuni dei quali possiedono anticodoni che riconoscono 2 o più codoni diversi.
L'oscillazione è la minor rigidità delle regole di appaiamento degli anticodoni, e spiega il perchè diversi codoni che codificano lo stesso amminoacido differiscono solo nella loro terza base (ovvero la terza base U del tRNA può appaiarsi ad esempio con A o G dell'mRNA).

Il legame codone anticodone deve essere preceduto da un corretto appaiamento tra il tRNA e il suo amminoacido, e questo legame viene fatto dall'enzima amminoacil-tRNA sintetasi, di cui ne esistono 20, ciascun per ogni amminoacido.

I ribosomi favoriscono l'accoppiamento tra gli anticodoni del tRNA e i codoni dell'mRNA durante la sintesi delle proteine.
Il ribosoma è costituito da 2 subunità, la subunità maggiore e la subunità minore, costituite entrambe da RNA ribosomiale (rRNA), che costituisce 2/3 della massa di un ribosoma.
Il ribosoma possiede 3 siti di legame del mRNA: il sito P lega il tRNA che trasporta la catena in accrescimento, il sito A lega il tRNA che trasporta l'amminoacido che deve essere aggiunto alla catena, il sito E è dove i tRNA liberi abbandonano il ribosoma.
Il ribosoma tiene vicini tRNA e mRNA e posiziona il nuovo amminoacido facendolo aggiungere all'estremità carbossilica del polipeptide nascente.

La sintesi di una catena polipeptidica è costituita di 3 fasi: inizio, allungamento, terminazione.
L'inizio e l'allungamento necessitano di consumo di energia fornita dall'idrolisi di GTP.
L'inizio prevede l'associazione dell'mRNA, del tRNA che trasporta il primo amminoacido del polipeptide e delle 2 subunità del ribosoma.
Nell'allungamento gli amminoacidi sono aggiunti uno alla volta all'amminoacido precedente, e avviene in un ciclo di 3 tappe: riconoscimento del codone, formazione del legame peptidico, trasferimento.
La terminazione è l'ultima tappa della traduzione dove l'allungamento prosegue fino a che non trova un codone di stop (triplette UAA, UAG e UGA) nell'mRNA nel sito A del ribosoma, e in quel caso al sito A si lega una proteina detta fattore di rilascio che comporta l'idrolisi del polipeptide nel sito P, provocandone il rilascio dal ribosoma.

Una molecola di mRNA è solitamente usata per produrre diverse copie simultanee di un polipeptide, grazie a diversi ribosomi che operano contemporaneamente.
Quando un ribosoma si sposta oltre il codone d'inizio, un altro ribosoma può legarsi all'mRNA, e così via, formando un poliribosoma, una struttura che velocizza la produzione di polipeptidi.

Dopo la sintesi il polipeptide inizia ad avvolgersi per raggiungere la forma strutturale giusta per il suo funzionamento, conformazione determinata dalla struttura primaria, a sua volta determinata dal gene.
La proteina chaperone favorisce il corretto ripiegamento del polipeptide (folding) in modo che risulti una proteina funzionale, mentre il fenomeno della denaturazione si ha quando la proteina perde la sua forma e diventa quindi inattiva.

Esistono 2 tipi di ribosomi, i ribosomi liberi e i ribosomi legati.
I liberi sono sospesi nel citosol e sintentizzano proteine solubili che svolgeranno la loro funzione nel citosol, quelli legati sono attaccati nel reticolo endoplasmatico rugoso ERr e producono proteine per sistemi di membrane interne e proteine che possono essere esportate fuori dalla cellula.
I ribosomi liberi e legati sono identici e possono scambiarsi di posto.
La sintesi di tutte le proteine inizia nel citosol e li termina, a meno che il peptide nascente non spinga il ribosoma a legarsi col ER.
I polipeptidi destinati ai sistemi membranosi presentano quindi un peptide segnale che li indirizza verso l'ER.
La particella di riconoscimento del segnale (SRP) favorisce il legame tra il ribosoma e la proteina recettoriale della membrana dell'ER, dove riprende la sintesi e viene rimosso il peptide segnale.

Tipi di RNA eucariotici

RNA messaggero mRNA	Trasporta le informazioni dal DNA ai ribosomi
RNA transfer tRNA	Traduce i codoni dell'mRNA in amminoacidi
RNA ribosomiale rRNA	Svolge ruoli catalitici e funzionali all'interno dei ribosomi
Trascritto primario (es pre-mRNA)	Fa da precursore all'mRNA, all'rRNA e al tRNA
Piccolo RNA nucleare snRNA	Svolge ruoli strutturali e catalitici negli spliceosomi
SRP RNA	Complesso di RNA e proteine che riconosce i peptdi segnale dei polipeptidi indirizzati verso l'ER

Mutazioni puntiformi
Le mutazioni sono modificazioni del materiale genetico, le mutazioni puntiformi sono modificazioni chimiche a carico di una sola coppia di basi di un gene.
Se una mutazione puntiforme avviene in un gamete, questa può essere trasmessa a tutta la progenie, e se la mutazione comporta un effetto sul fenotipo, essa viene definita come malattia ereditaria.
Le mutazioni puntiformi possono essere divise in 2 categorie: sostituzioni di coppie di basi e inserzioni o delezioni di coppie di basi.

Le sostituzioni consistono nella sostituzione di un nucleotide e del suo partner sul filamento complementare con un'altra coppia di nucleotidi.
Una variazione di una coppia di basi può trasformare un codone in un altro che è tradotto dal medesimo amminoacido, facendo una mutazione silente, ovvero non influente sul funzionamento della proteina, mentre altre sostituzioni possono comportare la sostituzione dell'amminoacido, che però non influenzerà lo stesso il funzionamento della proteina.
In altri casi le sostituzioni di amminoacidi comportano la modificazione delle funzioni della proteina, in alcuni casi creando nuove funzionalità, in altri danneggiandone il normale funzionamento.
Le sostituzioni sono di solito mutazioni di senso (missense), cioè quando il codone modificato codifica ancora un amminoacido e quindi ha un senso, non necessariamente giusto, invece le sostituzioni che mettono un segnale di stop sono dette mutazioni non senso (nonsense) e quasi tutte portano alla produzione di proteine non funzionali.

Le inserzioni e le delezioni sono mutazioni in cui si verifica l'aggiunta o la perdita di coppie di nucleotidi di un gene, e sono mutazioni dall'effetto disastroso perchè possono alterare la griglia di lettura, nel fenomeno detto mutazione di spostamento della griglia di lettura (frameshift mutation), che avverà ogni volta in cui il numero di nucleotidi non è multiplo di 3, e a meno che questo spostamento non avvenga verso la fine del gene, produrrà una proteina quasi sicuramente non funzionale.

Altri errori possono verificarsi attraverso mutazioni spontanee, mutazioni che coinvolgono grossi frammenti di DNA.
I mutageni sono agenti fisici e chimici che interagiscono col DNA causando la mutazione.
Possono essere raggi X, luce ultravioletta, e possono comportare l'appaiamento in modo improprio durante la replicazione del DNA, o far replicare male il DNA inserendosi al suo interno e formando una distorsione della doppia elica, altri invece modificano le basi chimicamente, alterando l'appaiamento.
Gran parte dei cancerogeni sono mutageni e gran parte di mutageni sono cancerogeni.

Il gene può avere diverse definizioni, può essere considerato un'unità ereditaria in grado di inluenzare un carattere fenotipico, può essere il sinonimo di locus, può essere una porzione di una specifica sequenza nucleotidica lungo una molecola di DNA.
Si può cmq dire che un gene è una regione di DNA il cui prodotto finale è un polipeptide o una molecola di RNA.