Genetica (8/8): Tecnologia del DNA e genomica

La maggior parte dei metodi usati per clonare frammenti di DNA possiede alcune caratteristiche in comune, ad esempio c'è un metodo che utilizza i batteri e i loro plasmidi.
I plasmidi sono piccole molecole di DNA circolare che si replicano all'interno delle cellule batteriche, indipendentemente dal cromosoma batterico.
Per poter clonare geni o frammenti di DNA si isolano i plasmidi batteri, si inserisce un gene estraneo all'interno del plasmide ed infine lo si reinserisce nella cellula batterica, dove si riproduce formando un clone cellulare che contiene anche il gene estraneo e questo clone batterico produrrà la proteina codificata dal gene estraneo.
La clonazione può servire per ottenere prodotti proteici per la ricerca o per la produzione di massa di geni specifici.

Gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano le molecole di DNA su di un numero limitato di regioni specifiche.
Gli enzimi di restrizione proteggono i batteri dal DNA estraneo e funzionano tagliando questo DNA mediante un processo noto come restrizione.
La maggior parte di questi enzimi è altamente specifica, e la cellula batterica protegge il proprio DNA dalla restrizione con l'aggiunta di gruppi metilici (-CH₃) all'interno di sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione.
La sequenza di riconoscimento viene detta sito di restrizione, questi siti sono solitamente simmetrici e hanno la stessa sequenza 5'->3' costituita da 4 o 8 nucleotidi, riconoscibile su entrambi i filamenti ma orientata in direzioni opposte.
Gli enzimi di restrizione tagliano i legami su entrambi i filamenti, e dato che di solito queste sequenze sono presenti più volte nel DNA, lo stesso enzima potrà effettuare più tagli.
Quando sono sottoposte all'azione di un determinato enzima, le copie di una molecola di DNA generano sempre lo stesso insieme di frammenti di restrizione, quindi un enzima di restrizione taglia una molecola di DNA in modo riproducibile.
Nei frammenti prodotti è presente almeno una breve regione terminale a singolo filamento, detta estremità adesiva, che si appaierà temporaneamente con pochi legami idrogeno sul singolo filamento delle altre molecole di DNA tagliate con lo stesso enzima, e questi appaiamenti potranno essere stabilizzate con l'enzima DNA ligasi, che salda i filamenti assieme catalizzando la formazione di legami fosfodiestere.
Si ha così del DNA ricombinante, ovvero una molecola ottenuta dall'unione di DNA proveniente da 2 fonti diverse.

I plasmide originale viene chiamato vettore di clonazione ed è una molecola di DNA che può trasportare DNA estraneo all'interno della cellula e replicarlo.

La clonazione in un plasmide batterico
Si seguono 5 passaggi per la clonazione di un gene:

1. Isolamento del vettore e del DNA del gene da clonare
2. Inserimento del DNA all'interno del vettore: tramite enzima di restrizione vengono tagliati il DNA estraneo e quello dei plasmidi e i vari frammenti si appaieranno mescolandosi grazie alle estremità adesive, che poi verranno fissate dal DNA ligasi con legami covalenti.
3. Introduzione del vettore di clonazione all'interno delle cellule: in alcuni casi tramite il processo della trasformazione.
4. Clonazione delle cellule
5. Identificazioni dei cloni: si può usare l'ibridazione seguendo la sonda marcata con isotopi radioattivi che si legherà ai filamenti del gene desiderato, poi si userà la denaturazione del DNA cellulare per separare i 2 filamenti.

Clonazione per eucarioti in procarioti
Un vettore di espressione è un vettore di clonazione che contiene il promotore procariotico necessario per ottenere un gene eucariotico clonato che funzioni in un sitema procariotico.
Il DNA complementare (cDNA) è quel DNA che viene prodotto tramite trascrittasi inversa di mRNA eucariotico, in modo da supplire all'incompatibilità del DNA eucariotico (pieno di introni) con quello di destinazione procariotico.
I cromosomi di lievito artificiali (YAC) sono dei vettori che combinano le caratteristiche essenziali del cromosoma eucariotico con il DNA estraneo.
L'elettroporazione si ha quando viene applicato un impulso elettrico alla soluzione che contiene le cellule, grazie al quale si forma un forellino nella membrana citoplasmatica dal quale entra il DNA nella cellula.
Per l'espressione di un gene clonato eucariotico si usano cellule eucariotiche perchè molte proteine se non sono modificate dopo la traduzione non funzionano, e i procarioti non possono modificarle.

La biblioteca genomica è l'insieme di plasmidici ricombinati, ognuno dei quali contiene un segmento particolare del genoma iniziale (esiste anche la biblioteca di cDNA).

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica con la quale qualsiasi pezzo di DNA può essere rapidamente copiato più volte senza l'uso di cellule.
Il DNA viene incubato in provetta in presenza della polimerasi, di nucleotidi e di brevi filamenti di DNA sintentico a singolo filamento, e la PCR permette così di generare miliardi di copie di uno specifico segmento di DNA in poche ore, in un ciclo a 3 tappe, dove non è necessario partire da un campione puro, ma basta una piccola quantità di DNA interessato, tuttavia, la PCR commette diversi errori occasionali e quindi non può sostituire la clonazione quando si vogliono molte copie.

Analisi del DNA e genomica

La genomica si occupa dell'analisi delle sequenze di interi genomi, in modo da poterle usare come punto di partenza per lo studio di vari insiemi di geni e delle loro interazioni.
L'elettroforensi su gel è una tecnica che permette la separazione delle macromolecole in base alle loro dimensioni, alla carica elettrica o altre proprietà fisiche, essa separa le macromolecole in base alla loro velocità di migrazione su di un gel posto all'interno di un campo elettrico.
L'elettroforensi suddivide una miscela di molecole di DNA in bande, ciascuna delle quali è costituita da moleocle di DNA della stessa lunghezza.

L'analisi dei frammenti di restrizione individua indirettamente le differenze di sequenza tra molecole di DNA, tramite elettroforensi su gel.
Molte molecole possono essere identificate osservando i loro quadri di frammenti di restrizione, che possono essere recuperati in modo da ottenere campioni puri.

La tecnica del southern blotting può essere utilizzata per confrontare il DNA di soggetti diversi.
Questa tecnica si basa sull'ibridazione degli acidi nucleici, e i risultati possono mostrare sia la presenza di una particolare sequenza in un campione di DNA, ma anche i frammenti di restrizione che contengono quella sequenza.
Prima si preparano dei frammenti di restrizione (DNA + enzima di restrizione), poi le miscele dei frammenti di restrizione di ciascun campione vengono separate per elettroforensi, poi si usa il blotting, tramite una soluzione alcalina i singoli filamenti di DNA rimangono adesi alla carta, disposti a bande, c'è poi l'ibridazione con la sonda radioattiva ed infine l'autoradiografia permette di individuare le bande di DNA che si appaiano con la sonda.

I polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) sono differenze nelle sequenze del DNA di cromosomi omologhi, che danno origine a diversi tipi di frammenti di restrizione.
L'RFLP può essere usata come marcatore genetico di un particolare locus del genoma.
Gli RFLP vengono individuati e studiati grazie al southern blotting, e dato che gli RFLP sono ereditati in maniera mendeliana, essi possono essere usati come marcatori genetici per costruire mappe di associazione, e la frequenza con cui 2 RFLP sono ereditati assieme è una misura della vicinanza dei 2 loci su un cromosoma.

Nel 1980 il biologo David Botstein affermò che le variazione del DNA osservate negli RFLP potevano essere usate come base per la mappatura dettagliata del genoma umano.
Nel 1990 è partito invece il progetto genoma umano che si propone di mappare l'intero genoma umano attraverso la determinazione della sequenza nucleotidica completa del DNA di ciascun cromosoma, progetto sviluppato in 3 fasi:

1. Mappatura genetica: la costruzione di una mappa di associazione delle svariate migliaia di marcatori genetici presenti nei cromosomi, e basandosi solo sui microsatelliti, i ricercatori hanno completato una mappatura genetica umana con circa 5000 marcatori.
2. Mappatura fisica: le distanze tra i marcatori vengono espresse con una misura fisica (di solito col numero di nucleotidi), e viene tagliato il DNA di ciascun cromosoma in un numero di frammenti di restrizione identificabili (preparati tramite clonazione), determinando l'ordine effettivo dei frammenti nel cromosoma.
   I frammenti sovrapponibili vengono identificate tramite sonde col metodo del chrmosome walking.
   Gli scienziati determinano l'ordine dei lunghi frammenti e poi tagliano ciascuno di essi in pezzi più piccoli che vengono clonati e ordinati.
3. Sequenziamento del DNA: è la sequenza nucleotidica completa di un genoma che parte dai frammenti ordinati di DNA, la cui sequenza nucleotidica può essere determinata con l'uso di un sequenziatore.
   La tecnica di sequenziamento rapido marca il DNA e lo si sintetizza con l'impiego di nucleotidi speciali che terminano la catena e tramite l'ettroforensi su gel ad alta risoluzione.

Nel 1992 il biologo Craig Venter propose un approccio alternativo per il sequenziamento di genomi interi, propose infatti di saltare le prime 2 fasi di mappatura e di passare dirattamente al sequenziamento grazie all'utilizzo di potenti computer.
Il genoma umano è in fase di completamento, tuttavia sono state scoperte alcune cose interessanti, come il fatto che il genoma umano è per l'85% uguale a quello del topo.

Per facilitare le ricerche, le sequenze di DNA già analizzate sono raccolte in banche dati elettroniche raggiungibili dai ricercatori di tutto il mondo.
Tra le varie scoperte fatte, c'è quella che il genoma umano contiene pochi geni, circa 30000-40000, solo 2-3 volte maggiore di quelli del moscerino della frutta, e che soltato una porzione molto piccola del DNA umano è rappresentata da geni, la restante parte è costituita da DNA ripetitivo e introni lunghi.
Inoltre, il confronto di sequenze genomiche conferma pienamente i collegamenti evolutivi anche tra organismi molto distanti.
Un tipico gene umano specifica di solito almeno 2 o 3 polipeptidi diversi, utilizzando diverse combinazioni di esoni.

Studio dell'espressione genica
Lo studio dei genomi è importante sia per conoscere nuovi geni e capire come si evolvono, sia per capire come i geni agiscono assieme per generare un organismo e farlo funzionare.
Mediante la tecnica del DNA microarray, piccole quantità di numerosi frammenti di DNA a singolo filamento che rappresentano geni distinti, sono fissate su un vetrino e sono sottoposti ad ibridazione con diversi campioni di cDNA marcato con coloranti.
Questa tecnica serve per individuare nuovi geni, capire come interagiscono tra di loro e come funzionano, inoltre questa tecnica è usata anche per confrontare tessuti tumorali con tessuti sani.

Determinare il funzionamento dei geni
Per capire come un gene opera, a volte lo si disattiva e si guardano le differenze nell'organismo, un metodo è quello della mutagenesi in vitro, una tecnica che introduce cambiamenti specifici nella sequenza di un gene clonato, mutazioni che possono bloccare la funzione del prodotto proteico quando esso viene reinserito nella cellula.
Con l'interferenza da RNA (RNAi) si arresta l'espressione dei geni impiegando molecole di RNA sintetico a doppio filamento che corrispondono alla sequenza di un particolare gene, per innescare la demolizione dell'RNA messaggero corrispondente al gene.

La proteomica è lo studio sistematico dell'intero insieme delle proteine codificate dal genoma.
Il numero delle proine è molto superiore a quello dei geni, a causa dello splicing alternativo e delle modificazioni post-traduzione.
La bioinformatica è l'applicazione delle scienze informatiche e matematiche alla genetica ed altri campi della biologia.
I polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP) sono variazioni di singole coppie di basi del genoma che sono la causa della nostra diversità genomica, piccola diversità rispetto alle altre specie.

Applicazioni pratiche della tecnologia del DNA

Grazie allo studio del genoma umano si possono identificare le mutazioni responsabili delle malattie, i ricercatori possono diagnosticare centinaia di disordini genetici umani impegnando la tecnologia del DNA.

La terapia genica è l'alterazione dei geni di un individuo affetto da qualche malattia.
Le cellule devono ricevere un allele normale e duplicarsi, tuttavia questo metodo ha per ora poco successo a causa della brevità del funzionamento di questi geni.

Grazie alla tecnologia del DNA sono stati creati diversi prodotti farmaceutici, prevalentemente proteine, ad esempio sono stati prodotti l'insulina e l'ormone della crescita (hGH) e l'attivatore del plasminogeno tissutale (TPA) che aiuta a prevenire l'infarto.
La pecca di questi prodotti è che sono molto costosi.
Un altro esempio di prodotto genetico è il vaccino è una variante innocua o un derivato di un agente patogeno che stimola il sistema immunitario a combattere il patogeno.
I vaccini sono di 2 tipi: particelle di virus virulento inattivo e particelle di virus attivo di ceppo virale attenuato.

L'esame del DNA è usato anche in campo legale, dato che può portare all'identificazione del colpevole di un crimine, grazie all'analisi del RFLP tramite Southern blotting che richiede poche quantità di sangue o di un altro tessuto.
Il fingerprint del DNA, impronta digitale del DNA, è un profilo specifico di bande che può essere impiegato in campo legale, ed esso ultimamente è prodotto usando le variazioni della lunghezza del DNA satellite al posto degli RFLP, dato che queste ripetizioni tandem semplici (STR) variano da persona a persona e sono considerate attendibili.
Maggiore è il numero di marcatori del DNA esaminati in un campione e più il fingerprint di un individuo è unico.
La PCR è invece utile quando il DNA è di bassa qualità o in piccole quantità.
Gli esami legali del DNA si concentrano solo su 5 piccole regioni del genoma, che sono note per avere un'alta variabilità tra persone, tanto che la possibilità di avere lo stesso fingerprint è di 1/100000 e 1/un miliardo, a seconda dei marcatori confrontati e dalla frequenza di questi marcatori all'interno della popolazione.

Un altro impiego è quello ambientale, dove ad esempio sono stati sviluppati alcuni ceppi batterici che possono degradare i composti rilasciati durante le perdite di petrolio in mare.

La tecnologia del DNA viene anche utilizzata in agricoltura per produrre piante più resistenti ai batteri e agli insetti, e che producano maggiori proteine/vitamine.
Gli organismi transgenici sono quegli organismi i cui genomi contengono geni di altre specie, ad esempio si può creare una pecora che produca lana migliore, oppure generare un animale transgenico usabile come fabbrica di farmaci.
L'animale transgenico viene generato prendendo le cellule uovo dall'animale ricevente, clonando il gene da l'animale donatore, e impiantando l'uovo col gene nel ricevente, che farà una prole transgenica.
Le piante sono molto usate perchè le cellule vegetali sono facilmente manipolabili e perchè costerebbe meno produrre proteine umane e vaccini tramite piante che tramite clonazione classica, e ciò è reso possibile perchè alcune piante sono in grado di generarsi completamente da una singola cellula.
Il vettore usato per introdurre nuovi geni all'interno delle cellule vegetali è il plasmide Ti.

A causa di vari problemi di etica gli scienziati hanno sviluppato diverse regole di autocontrollo, anche per evitare incidenti con geni mutanti che potrebbero essere molto pericolosi, creando laboratori con sistemi di sicurezza molto avanzati e generando geni sperimentali che non possano vivere fuori dal laboratorio.
Sugli organismi geneticamente modificati (OGM) (organismi che hanno acquisito uno o più geni artificiali) si è discusso molto per decidere se sia eticamente giusto alterare la natura, ma è indiscussa la loro utilità in campi come l'agricoltura, o nel campo alimentare (animali), ed alcuni paesi han deciso di adottare un marchio per indicare gli OGM quando vengono venduti.

Per evitare la diffusione dei geni manipolati i ricercatori sono anche in grado di crearli in maniera che non possano essere trasmessi, e per evitare i vari rischi della tecnologia genetica gli Stati Uniti hanno istituito vari enti di controllo, come la Food and Drug Administration, il National Institute of Health e il Department of Agricolture.
La tecnologia del DNA è una scoperta importante che va però portata avanti con molta cura e prudenza. 

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